การเก็บรักษาเซลลต้นกําเนิดโดยการแช่แข็ง สันติ ฆ้องวง (44,239 views) first post: Thu 3 April 2008 last update: Thu 3 April 2008 เมื่อทําการเก็บเซลลตนกําเนิดเรียบร้อยแล้ว หากไมทําการฉีดเซลล กลับคืนใหกับผู้ป่วยในทันที ก็จะนิยมนําเซลลต้นกําเนิดแชแข็งเก็บไวก่อน วิธีการเก็บรักษาเซลล ต้นกําเนิดโดยการแช่แข็งนี้เรียกว่า C

 สันติ ฆ้องวง

           ปัจจุบันเซลลต้นกําเนิด นับเป็นความหวังใหมทางการแพทยที่ใชในการรักษาโรค ซึ่งเกิดจากภาวะความเสื่อมแห่งวัยและการบาดเจ็บ ในอวัยวะต่างๆ โดยการปลูกถ่ายเซลลต้นกําเนิดเข้าไป แล้วสรางเซลลและเนื้อเยื่อใหม ทดแทนเซลลและเนื้อเยื่อเดิมที่เสื่อมสภาพไป

           ในช่วงสิบกว่าปที่ผ่าน มีสาขาวิชาทางการแพทยเกิดขึ้นใหมที่เรียกว่า   Regenerativemedicine ซึ่งเป็นสาขาที่นําเอาความรูและเทคโนโลยีของเซลลต้นกําเนิดขึ้นมาใช โดยเซลลต้นกําเนิดที่นํามาใชประโยชนกันอย่างแพรหลายในปัจจุบัน เป็นเซลลต้นกําเนิดที่ไดมาจากเนื้อเยื้อที่โตเต็มวัย (Adult stem cell) ไดแก เซลลต้นกําเนิดจากไขกระดูก เซลลตนกําเนิดจากเลือดสายสะดือทารก และเซลลต้นกําเนิดจากกระแสโลหิตซึ่งไดจากการฉีดยาที่ชื่อว่า G-CSF กระตุ้นใหไขกระดูกสร้างเซลลต้นกําเนิดออกมาในปริมาณมากและไหลเวียนเข้าสูกระแสโลหิต จากนั้นจึงใชเครื่อง Apheresis ทําการเก็บเซลลต้นกําเนิดจาก
กระแสโลหิตออกมา

         โดยปกติแล้ว เมื่อทําการเก็บเซลลต้นกําเนิดเรียบร้อยแล้ว หากไมทําการฉีดเซลลกลับคืนใหกับผูป่วยในทันที ก็จะนิยมนําเซลลต้นกําเนิดแชแข็งเก็บไวก่อน วิธีการเก็บรักษาเซลลต้นกําเนิดโดยการแช่แข็งนี้เรียกว่า   Cryopreservation ซึ่งก่อนที่จะนําไปแช่แข็ง ต้องผ่านกระบวนการเติมสาร Cryoprotective agent   ก่อน จากนั้นจึงค่อยๆ ลดอุณหภูมิลงโดยใชเครื่องControlled rate freezer เพื่อป้องกันการเกิดเป็นผลึกน้ำแข็งขึ้นภายในเซลล เมื่อทําการลดอุณหภูมิของเซลลตนกําเนิดไดตามอุณหภูมิที่ตองการแล้วจึงย้ายเซลลต้นกําเนิดไปเก็บไวใน ถังไนโตรเจนเหลวต่อไป

หลักการของ Cryopreservation

กระบวนการ Cryopreservation เปนเทคนิคที่ใชในการเก็บรักษาเซลลหรือเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิต ทั้งเซลลของมนุษย สัตว พืชและเชื้อจุลินทรียตางๆ ภายใตสภาวะอุณหภูมิที่เย็นจัด
(Ultra low temperature) เพื่อที่จะสามารถทําการเก็บรักษาเซลลหรือเนื้อเยื่อใหไดเป็นระยะ
เวลานาน (Long term preservation) หลักการของเทคนิคนี้ คือ การทําใหน้ำภายในเซลลเปลี่ยน
สถานะไปเปนของเหลวหนืด ไมผ่านขั้นตอนการเปนผลึกน้ำแข็ง ซึ่งผลึกน้ำแข็งดังกลาวนี้จะมีผล
ทําให Viability ของเซลลลดลง โดยใชสารCryoprotective agent เป็นตัวช่วยป้องกันไมให
เกิดผลึกน้ำแข็งขึ้นภายในเซลล เมื่อทําการลดอุณหภูมิของเซลลต่ำลงไปจนถึงจุดวิกฤต
(Critical point) คือ -135 องศาเซลเซียส เซลลก็จะกลายเปนของแข็งมีลักษณะเหมือนแกว วิธีการ
ทําใหเซลลแข็งเป็นแก้วนี้เรียกว่า   Vitrification   และสามารถเก็บรักษาเซลลไดนานถึง 20 ป

แต่โดยหลักการแล้ว หากเซลลถูกแช่แข็งจนผ่านจุดวิกฤตหรือต่ำกว่า -135 องศาเซลเซียสไปแลวเซลลเหล่านั้นก็จะสามารถมีชีวิตอยูไดตลอดไปตราบใดที่เรามีไนโตรเจนเหลวรักษาอุณหภูมิของเซลลไวต่ำกว่า critical point ได้อย่างไรก็ตาม

ปัจจุบันยังไมมีงานวิจัยชิ้นใดที่ระบุชัดเจนว่าสามารถเก็บเซลลไดนานสูงสุดเทาไร ขอมูลสวนใหญระบุไวคือ เก็บไดประมาณ 20 ป ในกระบวนการแช่แข็งเซลลตนกําเนิด เพื่อเก็บรักษาเซลลไวเปนระยะเวลานาน และใหมีคุณภาพดีนั้นจะต้องมีข้อที่ควรคํานึงถึงหลายประการดังนี้

Cryoprotective agents

              Cryoprotective agents นั้นเป็นสารที่ช่วยในการป้องกันเซลลใหมีชีวิตรอด อันเนื่องมาจากการแชเซลลในอุณหภูมิที่เย็นจัด เป็นระยะเวลานานโดยสารดังกล่าว มีคุณสมบัติในการป้องกันเซลลดังนี้ - ช่วยลดความเข้มข้นของเกลือภายในเซลลไมใหสูงเกินไป

- ลดปัญหาการเกิดเซลล์หดตัว ในช่วงการลดอุณหภูมิลง
- ลดการแตกตัวของสารละลาย ที่เกิดจากการแข็งตัวในช่วงที่ลดอุณหภูมิลง
- ลดการเกิดผลึกน้ำแข็งขึ้นภายในเซลลสารเคมีที่นิยมนํามาใชเป็น Cryoprotective agent   เช่น DMSO, polyvinylpyrrolidone, Dextrans,Glycols และ glycerol เป็นต้น

               แตในปัจจุบันไดมีผู้ทําการคิดค้นนํา Cryoprotective agent หลายชนิดมาผสมกันเป็น Cryoprotective agent ตัวใหมซึ่งใหผลในการรักษาคุณภาพและความมีชีวิตของเซลลดีกวาการใช Cryoprotective agent เพียงตัวเดียว เช่น     DMSO/Dextrans  เป็นต้น เราสามารถแบ่ง Cryoprotective agent ออกเป็นสองประเภทตามคุณสมบัติการทํางาน ได้แก

- Intracellular cryoprotectants สารประเภทนี้เป็นสารที่มีมวลโมเลกุลต่ำ จะสามารถแทรกซึมผาน cell membrane เข้าไป เพื่อช่วยปกป้องส่วนประกอบภายในเซลล ไม่ใหถูกทําลายจากอุณหภูมิที่เย็นจัด ตัวอย่างสาร   Cryoprotective agentประเภทนี้ เช่น Glycerol และ DMSO   เป็นต้น
- Extracellular cryoprotectants เป็นสารที่มีมวลโมเลกุลสูง ไมสามารถแทรกซึมผ่าน cell membrane เข้าไปภายในเซลล์ได้    แต่จะช่วยป้องกันเซลลจากภายนอกเมื่อเซลลถูกลดอุณหภูมิลงอย่างรวดเร็วลดการเกิดผลึกน้ำแข็ง ช่วยในการเกิดVitrification จากภายนอกเซลล หรือที่เรียกวา extracellular glass formation
ตัวอยางสาร Cryoprotective agent  ประเภทนี้ เช่น Hydroxy ethyl starch(HES) และPolyvinylpyrrolidone เป็นต้น

ดังนั้นก่อนที่จะทําการแช่แข็งเซลล ควรเลือกใช Cryoprotective agent ใหเหมาะสมกับชนิดและปริมาณของเซลลด้วย

Controlled Rate Freezer

           หลังจากที่เราทําการเติมสาร   Cryoprotective  agent เรียบร้อยแล้ว ก็จะเป็นขั้นตอนของการแชแข็งเซลลต้นกําเนิด โดยการใชเครื่อง Controlled  Rate Freezer ซึ่งเครื่องมือนี้จะค่อยๆ ทําการลดอุณหภูมิลงทีละ 1 องศาเซลเซียสตอนาที ไปจนถึงอุณหภูมิสุดทายตามโปรแกรมที่เราตั้งไวกอนที่จะนําเซลลต้นกําเนิด ลงในเครื่อง
Controlled Rate Freezer เพื่อทําการลดอุณหภูมินั้น ควรเก็บเซลลไวที่อุณหภูมิประมาณ 4 องศาเซลเซียสตลอดเวลา จนกว่าจะทําการตั้งค่าและโปรแกรมต่างๆ ของเครื่อง Controlled RateFreezer เสร็จ เนื่องจาก DMSO เปนสารที่มีความรอน หากไมทําใหเย็นจะมีผลกับ Viability ของเซลล

ในช่วงต้นของโปรแกรมการลดอุณหภูมิ โดยเครื่อง Controlled Rate Freezer นั้น จะมีชวงหนึ่งที่เซลลตนกําเนิดจะปลดปลอยความร้อน ภายในเซลลออกมา ซึ่งเราตองตั้งโปรแกรมเครื่องControlled Rate Freezer ใหทําการเพิ่มอุณหภูมิใหสูงกลับขึ้นไปอีกเล็กน้อย เพื่อลดปญหาเซลลตาย เนื่องจากอุณหภูมิที่ลดลงอย่างรวดเร็วปะทะกับความรอนที่เซลลปลดปล่อยออกมา จุดที่ทําการเพิ่มอุณหภูมิใหสูงกลับไปขึ้นไปอีกนั้นเรียกว่า Nucleation point หลังจากนั้น เครื่องControlled Rate Freezer จึงจะทําการลดอุณหภูมิลงทีละ 1 องศาเซลเซียสตอไปจนถึงอุณหภูมิสุดทายตามที่ตั้งโปรแกรมไว ดังแสดงในภาพ
 

               เมื่อเครื่อง Controlled Rate Freezer ทําการลดอุณหภูมิเซลลตนกําเนิดเสร็จเรียบรอยแลว จึงทําการยายเซลลตนกําเนิดจากเครื่อง Controlled Rate  Freezer ลงเก็บในถังไนโตรเจนเหลว เพื่อทําการเก็บเซลลในระยะยาวตอไปในกรณีที่ไมมีเครื่อง Controlled Rate Freezerใช เราสามารถใชวิธีการอื่นในการลดอุณหภูมิ
ของเซลลตนกําเนิดได ดังนี้

- นํา Freezing bag หรือ Cryovial ที่บรรจุเซลลตนกําเนิดใสลงในกล่องโฟมที่มีความหนาประมาณ 1 นิ้ว แล้วนํากล่องโฟมไปแชเย็นที่ตูเย็น -80 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 คืน (Overnight) จากนั้นจึงย้ายเซลลต้นกําเนิดลงถังไนโตรเจนเหลว
- นํา Freezing bag หรือ Cryovial ที่บรรจุเซลลตนกําเนิดใสลงในกล่องโฟมที่บรรจุ Isopropanol แล้วนํากล่องโฟมไปแช่เย็นที่ -80 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 8-12 ชั่วโมงกอนนําไปเก็บในถังไนโตรเจนเหลว เป็นต้น

วิธีการดังกล่าวนี้ สามารถใชแทนได หากไมมีเครื่อง Controlled Rate Freezer หรือเครื่องไมสามารถใชงานได แต Viability และคุณภาพของเซลลนั้น อาจจะน้อยลงไปบ้าง ทั้งนี้สามารถหาข้อมูลเพิ่มเติมไดจากงานวิจัยที่ตีพิมพทั่วไป

Developing Freezing Protocol

            ในกระบวนเก็บเซลลต้นกําเนิด โดยการแชแข็งที่อุณหภูมิเย็นจัดนั้น นอกจากตองคํานึงถึงปัจจัยตางๆ ที่กล่าวมาแล้ว วิธีการหรือโปรแกรมที่จะใชสําหรับเครื่อง Controlled Rate freezer ก็เปนเรื่องสําคัญ ควรเลือกใชโปรแกรมที่เหมาะสมกับชนิดและปริมาณของเซลลด้วย ตัวอย่างโปรแกรมสําหรับเครื่อง controlled rate freezer มี ดังนี้

 Conclusion

                จากที่กล่าวมาทั้งหมดข้างต้นนั้น เป็นเพียงส่วนสําคัญส่วนหนึ่งเท่านั้น เพื่อใหเห็นภาพรวมของการแชแข็งเซลลต้นกําเนิด หากในทางปฏิบัติจริงแล้ว ต้องคํานึงถึงปัจจัยตางๆ มากมาย เพื่อใหเซลลตนกําเนิดที่เก็บรักษาไวมีคุณภาพดีที่สุด ทั้งเรื่องถังไนโตรเจนเหลวที่ใชเก็บเซลล การเก็บเซลลในไนโตรเจนเหลวโดยตรง (Liquid phase)ซึ่งจะทําใหเก็บเซลลที่อุณหภูมิไดถึง -196 องศาเซลเซียส แตอาจจะมีปญหาเรื่อง Contamination  หรือ เก็บในไอเย็นของไนโตรเจนเหลว (Vaporphase) ซึ่งมีอุณหภูมิอยูที่ประมาณ -150 ถึง -170  องศาเซลเซียส แตจะไมมีปัญหาเรื่องContamination นอกจากนี้ อุปกรณและเครื่องมือต่างๆ ที่ใชป้องกันอันตราย จากไนโตรเจนเหลวก็เป็นสิ่งสําคัญที่ขาดไมไดเช่นกัน      เช่น ถุงมือป้องกันความเย็น แว่นตา และชุดสวมป้องกันไนโตรเจนเหลว  เป็นต้น   และที่ขาดไม่ไดก็คืออุปกรณที่ใชวัดปริมาณออกซิเจน (Oxygen  Detector) ในห้องปฏิบัติการ ที่มีถังไนโตรเจนเหลวและเครื่อง Controlled Rate Freezer ตั้งอยู เพื่อไม่ใหผู้ปฏิบัติงานเกิดอันตรายในกรณีที่ไนโตรเจนเหลวเกิดการรั่วไหล กลายเป็นก๊าซไนโตรเจน แทนที่ปริมาณออกซิเจนในอากาศ ซึ่งหากปริมาณออกซิเจนต่ำเกินไปผูปฏิบัติงานก็จะหมดสติหรือถึงแกชีวิตไดทั้งหมดที่กลาวมานี้เป็นหลักสําคัญ ที่ผู้ปฏิบัติงานควรปฏิบัติตามอย่างเคร่งครัด เพื่อใหเซลล์ต้นกําเนิดที่จะเก็บรักษาไว้มีคุณภาพดี และผู้ปฏิบัติงานปลอดภัยด้วย

References :

Brockbank K.G.M., Covaut J. and Taylor
M. Cryopreservation Guide. ThermoScientific. 2007.
Bromeyer Hal E. Umbilical Cord Blood
Banking Cord Blood: Biology,
Immunology, Banking and Transplantation
2004: 219-257. 

Miracele Medicine Co., Ltd.
Ratchakru Medical Center 3rd floor
Soi Ratchakru Paholyothin Rd., Phayathai,
Bangkok. Thailand, 10400
 

^*หมายเหตุ งานเขียนชิ้นนี้ ได้รับการคุ้มครองสิทธิตามพระราชบัญญัติคุ้มครองสิทธิทางปัญญา โดยลิขสิทธิเป็นของผู้เขียน ที่ให้เกียรตินำเผยแพร่ผ่าน วิชาการ.คอม เรามีความยินดีและอนุญาตให้ทำซ้ำหรือเผยแพร่ต่อเพื่อประโยชน์ทางการศึกษาเท่านั้น กรุณาให้เกียรติผู้เขียน โดยอ้างชื่อผู้เขียนและแหล่งข้อมูลทุกครั้งที่ทำการเผยแพร่ต่อ ห้ามนำส่วนหนึ่งส่วนใดไปเผยแพร่ต่อในสื่อที่เอื้อประโยชน์ทางธุรกิจก่อนได้รับอนุญาต ขอขอบคุณที่ร่วมกันช่วยสร้างให้สังคมไทยเป็นสังคมแห่งปัญญา

สงวนสิทธิ์ภายใต้สัญญาอนุญาต ครีเอทีฟคอมมอนส์ แสดงที่มา-ไม่ใช้เพื่อการค้า-ไม่ดัดแปลง 3.0 ประเทศไทย. ท่านสามารถนำเนื้อหาในส่วนบทความไปใช้ แสดง เผยแพร่ โดยต้องอ้างอิงที่มา ห้ามใช้เพื่อการค้าและห้ามดัดแปลง

ความเห็น 1 17 เม.ย. 2551 (15:29)
อื้ม..ซับซ้อน เก็บเอาไปอ่านต่อดีกว่า ^^

vmd
ร่วมแบ่งปัน39 ครั้ง - ดาว 720 ดวง - โหวตเพิ่มดาว

ไข่ต้มร้อนๆ
(ศุภเสกข์ ศรจิตติ)

ผู้ชมข้อมูลนี้แล้ว 7,193 ครั้ง
เป็นสมาชิก: นานกว่า 5 ปี
แบ่งปันความรู้ 42 ครั้ง
ได้รับดาว 163 ดวง

โหวตเพิ่มดาว

ขอบคุณผู้สนับสนุน