Agarose gel Electrophoresis











































 Agarose gel Electrophoresis 

อะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟไรซิส เป็นกระบวนการที่ใช้แยก DNA ของสารตัวอย่างโดยใช้ไฟฟ้าเพื่อตรวจหาองค์ประกอบของ
DNA ในสารตัวอย่างเพื่อประโยชน์ในการจำแนกลักษณะทางพันธุกรรมของสารตัวอย่าง

อุปกรณ์ในการทำอะกาโรสเจลอิเล็คโทรโฟไรซิส ประกอบด้วย
- เครื่อง Electrophoresis และ power supply
- เจลที่ใช้ทดสอบ
- Sample combs
- Electrophoresis buffer ซึ่งโดยปรกติจะใช้ Tris-acetate-EDTA (TAE)
หรือ Tris-borate-EDTA (TBE)
- Loading buffer ซึ่งประกอบด้วยสารละลายบางชนิด
- Ethidium bromide
- Transilluminator

ขั้นตอนการทำอะกาโรสเจลอิเล็คโทรโฟไรซิส มีดังนี้
1.ขั้นตอนการรินเจล
นำผง agarose ผสมกับ electrophoresis buffer จากนั้นก็นำเข้า microwave เพื่อให้ความร้อนจนหลอมเป็น
เนื้อเดียวกัน เพื่อให้ง่ายจะใช้ Ethidium bromide ความเข้าข้น 0.5 ug/ml ใส่เข้าไปในเจล จากนั้นทำให้เย็นถึงอุณหภูมิประมาณ
60 C จึงเทสารที่ได้ลงใน sample comb และจึงปล่อยให้เย็นตามอุณหภูมิห้องหลังจากที่เจลแข็งตัว เจลจะอยู่ในลักษณะคล้าย
พลาสติก
2.ขั้นตอนการแยก DNA ด้วยไฟฟ้า
นำเจลที่ได้ไปวางบนถาดและใส่ลงไปในเครื่องelectrophoresisในแนวตั้ง และใส่สาร DNA ตัวอย่างลงไปด้วย
จากนั้นก็ให้กระแสไฟเข้าในเครื่อง DNA ก็จะมีการเคลื่อนย้ายไปยังขั้ว anode ตามน้ำหนักโมเลกุล

""
รูปที่1 รูปแสดงการรินเจลและการนำเจลที่แห้งแล้วไปเข้าเครื่อง electrophoresis

ระยะทางที่ DNA ได้เคลื่อนไปในเจลสามารถเห็นได้ชัดจากการย้อมสี และส่วนต่าง ๆ ของ DNA ที่แยกออกมาจะมีค่า
ตั้งแต่ 300 – 4000 bpจากนั้นก็จะได้ภาพการแยกที่ชัดเจน ส่วนของ DNA ที่เคลื่อนไปใน agarose gels เป็นระยะทางต่าง ๆ
แปรผกผันกับ log10 ของน้ำหนักโมเลกุลของมัน นั่นคือถ้าคุณ plot กราฟระหว่างส่วนต่าง ๆ ของ DNA ที่เคลื่อนที่ได้กับกับlog10
ของน้ำหนักโมเลกุล จะได้แนวโน้มของแต่ละจุดคล้าย ๆ เส้นตรง จุดนี้มีความสำคัญในการหาค่าน้ำหนักโมเลกุลของแต
่ ละส่วนของ DNA ใน agarose gel ที่ต้องการ

"" ""
รูปที่2 แสดงภาพถ่ายอะกาโรสเจล ลักษณะของ band และ lane ที่เกิด

ภาพที่เกิดขึ้นจาก agarose gels ขึ้นอยู่กับปัจจัยต่าง ๆ ดังนี้
1.ความเข้มข้นของ agarose gel
2.ค่า voltage
3.ตัว buffer ใน electrophoresis

หลังจากที่เราทำกระบวนการ Agarose gel electrophoresis เรียบร้อยแล้ว เราจะได้ภาพถ่ายของ DNA ที่เคลื่อน
ไปใน agarose gels เป็นระยะทางต่าง ๆออกมาได้ดังรูป
""
รูปที่3 รูปแสดงภาพถ่ายอะกาโรสเจลหลังผ่านกระบวนการ Electrophoresis
ที่มา:
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html
" target="_blank">http://www.biochem.uwo.ca/community/molbio/agarose.html


" target="_blank">http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/geneconn/castgel/


 

""
""









 

ในกระบวนการทาง Digital Image Processing มีกระบวนการต่าง ๆ ทั้งหมดซึ่งจะกล่าวโดยรวมแล้วสามารถสรุป
ได้ดังแผนภาพดังต่อไปนี้
""
รูปที่4 รูปแสดงกระบวนการพื้นฐานใน Digital Image Processing

- Image Acquisition เป็นขั้นตอนแรกของกระบวนการนี้คือเป็นกระบวนการรับภาพที่ต้องการทำกระบวนการ Digital
Image Processing
- Image Enhancement เป็นกระบวนการพื้นฐานในการเข้าถึงรายละเอียดของภาพปรับปรุงภาพทำให้ภาพดูดีขึ้นโดยผ่าน
กระบวนการทางคณิตศาสตร์ต่าง ๆ
- Image Restoration เป็นกระบวนการปรับปรุงภาพออกมาให้เหมือนภาพตั้งต้นคล้ายกับ Image Enhancement แต่ว่า
ต่างกันตรงที่ Image Restoration เป็นการทำให้ภาพเหมือนภาพเดิมมากที่สุด แต่ Image Enhancement ไม่สนใจว่า
ภาพที่ออกมาจะเหมือนภาพเดิมหรือไม่ขอให้ออกมาดูดี
- Color Image Processing เป็นกระบวนการที่สำคัญกระบวนการหนึ่งเป็นการกล่าวถึงพวก color model และ color
processing
- Wavelets เป็นพื้นฐานของการแทนรูปภาพออกเป็นระดับต่าง ๆ ของ resolution
- Compression เป็นเทคนิกในการลดหน่วยความจำในการจัดเก็บรูปภาพ หรือลด bandwidth ในการเคลื่อนที่
- Morphological Processing เป็นเครื่องมือในการเลือกส่วนต่าง ๆ ของรูปภาพที่ใช้แทนหรืออธิบายในส่วนของรูปนั้น ๆ
- Segmentation กล่าวถึงส่วนของรูปภาพต่าง ๆจนมาประกอบรวมกันเป็นส่วนต่าง ๆ ของภาพและกล่าวถึง autonomous
segmentation เป็นส่วนที่ยากส่วนหนึ่งใน Digital Image Processing
- Representation and Description กล่าวถึง ผลลัพธ์ของ segmentation state ซึ่งจะเป็น แถวของข้อมูลในแต่ละ
pixel
- Recognition เป็นการสรุปกระบวนการทาง Digital Image Processing ต่าง ๆ ที่ได้พัฒนาในส่วนนี้


 

""
""









 

ขั้นตอนการคำนวณหาปริมาณโมเลกุลของแต่ละ Band
เมื่อผ่านกระบวนการ electrophoresis เรียบร้อยแล้วก็จะนำภาพที่ได้มาวิเคราะห์หาปริมาณโมเลกุลซึ่งมีหลักการคิดคำนวณ
ดังต่อไปนี้
ในกระบวนการทาง Digital Image Processing มีกระบวนการต่าง ๆ ทั้งหมดซึ่งจะกล่าวโดยรวมแล้วสามารถสรุปได้ดัง
แผนภาพดังต่อไปนี้

1.ทำการวัดระยะทาง (หน่วยเป็นมิลลิเมตร) จากจุดเริ่มต้นจนถึง Band นั้น ๆ ของสารตัวอย่าง โดย 1 สารตัวอย่าง ไม่เกิน 15
ค่าดังรูป
""
รูปที่5 แสดงการวัดระยะทางจากจุดเริ่มต้นถึง Band นั้น ๆ  

2.บันทึกค่า size ของ DNA ซึ่งเป็นค่ามาตรฐานและคำนวณหาค่า log(size) ดังตารางตัวอย่างด้านล่าง

""

ตารางที่ 1 ตารางแสดงการคำนวณหาปริมาณโมเลกุลของแต่ละ Band

3.นำค่า log(size) และระยะทางที่วัดได้ไป plot graph โดยให้ log(size) อยู่แกน y และระยะทางอยู่แกน x

""

รูปที่6 แสดงกราฟความสัมพันธ์ระหว่าง log(size) และระยะทางที่วัดได้

4.ประมาณค่ากราฟที่ได้ให้เป็นเส้นตรงและหาสมการของเส้นตรงดังรูป

""

รูปที่7 แสดงกราฟเส้นตรงจากการประมาณความสัมพันธ์

5.นำค่าระยะทางที่ได้แต่ละตัวแทนในสมการเส้นตรงที่คำนวณได้เมื่อซักครู่ ค่าที่ได้คือค่า log(size) ของ DNA
แต่ Band
6.ทำการปลด log ก็จะได้ค่าปริมาณโมเลกุลของแต่ละ Band ตามต้องการ

 

""
""








 

เมื่อมีข้อมูล n ชุดได้แก่

""

ต้องการสร้าาง function g(x) เพื่อใช้ประมาณ f(x) ดังนั้นจะมีค่าความผิดพลาดเป็น

""
ผลรวมกําลังสองของ error ที่จุด i = 1,…,n รวมกันจะเป็น
""
ใช้ g(x) เป็น polynomial degree m ในรูป

""

ดังนั้น
""
เพื่อให้ค่า E มีค่าต่ำสุด เราจะเลือกค่า a0 , a1 ,…, a m ที่เหมาะสมโดยการหาอนุพันธ์ของ Eในเทอม ai ให้เท่ากับ
0 (คิดเสมือนว่า ai เป็นตัวแปรส่วนตัวอื่น ๆ เป็นค่าคงที่หมด)

""
จะได้
""
เนื่องจากมี Unknown a 0 , a1 ,… ,a m อยู่ m+1 ตัวจะต้องมีสมการ m+1 สมการ ได้แก่

""
จะได้สมการที่ 1 เป็น
""
สมการที่ 1
""
สมการอื่น ๆ จะได้
""
j = 1,2,3,…,m
เมื่อจัดในรูป matrix จะได้

""
จากนั้นจึงทําการแก้สมการโดยวิธีการทาง matrix หาค่า a0 , a1 ,… ,a m ออกมา


25 พ.ค. 2552 13:09
0 ความเห็น
49297 อ่าน
No results found.

แสดงความคิดเห็น

กรุณา Login ก่อนแสดงความคิดเห็น